技術(shù)文章
Technical articles
更新時間：2024-10-21
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主要用途
組織CDK2/CYCLIN A激酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物，在CDK2/CYCLIN E抑制劑的存在下，受到CDK2/CYCLIN A磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光度法測定其氧化后峰值的變化，以分析組織裂解樣品中CDK2/CYCLIN A特異活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或純化酶樣品中CDK2/CYCLIN A激酶的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月
用戶自備
CDK2/CYCLIN A激酶：用于抑制劑篩選
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器
（微型）臺式離心機：用于細胞預(yù)處理
200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析
實驗步驟
一、 待測樣品準(zhǔn)備
1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重100至500毫克組織重量
2． （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗
4． （選擇步驟）抽去清理液
5． 移入到一個液氮凍存管
6． 即刻放進液氮罐過夜
7． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
8． 放進一個1.5毫升離心管
9． 加入置于冰槽里的xx至xx微升裂解液（Reagent B）
10． 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
11． 放進冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆茫?/span>
12． 即刻放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
13． 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
14． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
15． 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、 測定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如組織裂解懸液等），置于冰槽里
2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘）或0分鐘和5分鐘各測讀一次，并置零
3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、 背景對照測定
1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
4． 加入xx微升底物液（Reagent F）
5． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6． 加入xx微升陰性液（Reagent G）
7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘
四、 樣品測定
1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
4． 加入xx微升底物液（Reagent F）
5． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6． 加入10微升待測樣品（注意：50微克組織裂解蛋白；樣品須溶解）
7. 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8.即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘。
五、 酶標(biāo)儀測定
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
3． 分別加入xx微升酶促液（Reagent D）
4． 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
5． 分別加入xx微升底物液（Reagent F）
6． 輕輕搖動96孔板
7． 在30℃溫度下孵育3分鐘
8． 分別加入xx微升陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克組織裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
9． 輕輕搖動96孔板
10． 即刻放進酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
11． 活性計算：
六、抑制劑篩選
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、活性和待測抑制劑樣品
2． 按下表加入試劑，進行樣品預(yù)處理
內(nèi)容物 | 空背景對照 | 樣本背景 | 酶活性 | 待測抑制劑酶活性 |
緩沖液（Reagent C） | xx微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
陰性液（Reagent G） | xx微升 | xx微升 | xx微升 | —— |
待測抑制劑 | —— | xx微升 | ―― | xx微升 |
用戶自備的純化酶 | —— | —— | xx微升（1毫單位） | xx微升（1毫單位） |
96孔板每孔總量 | 空背景對照孔 （40微升） | 樣本背景孔 （40微升） | 活性孔 （40微升） | 待測抑制劑樣品孔 （40微升） |
輕輕搖動96孔板，混勻，放進30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進行下列操作 | ||||
3 3.3.3.3.分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
4． 分別加入xx微升酶促液（Reagent D）
5． 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
6． 分別加入xx微升底物液（Reagent F）
7． 輕輕搖動96孔板
8． 在30℃溫度下孵育3分鐘
9． 加入40微升上述預(yù)處理的待測樣品
10 即刻放進30℃酶標(biāo)儀檢測：測讀0分鐘和30分鐘
11 實際讀數(shù)：0分鐘讀數(shù)—30分鐘讀數(shù)
12 抑制活性計算：
當(dāng)前位置：
